Дифференциальная диагностика и выявление ДНК бледной и золотистой нематоды набором реагентов «Globodera rostochiensis и Globodera pallida-РВ»

Цистообразующие нематоды Globodera pallida и Globodera rostochiensis

Globodera pallida и Globodera rostochiensis — виды цистообразующих нематод, поражающих преимущественно растения семейства Solanum. Наибольший ущерб они наносят растениям картофеля, в меньшей степени поражают томаты и баклажаны. Центром происхождения цистообразующих нематод считают регион Центральных Анд в Южной Америке. В Европу эти вредители попали в середине 19-го века с селекционным материалом картофеля, а оттуда распространились по всему миру.

Цистообразующие картофельные нематоды — облигатные специализированные седентарные паразиты, для которых характерно наличие в жизненном цикле цист, содержащих яйца и инвазионные личинки. Потери урожая от них могут достигать более 80–90%, а при высокой инфекционной нагрузке урожай картофеля может быть полностью уничтожен. Основной диагностический признак G. pallida — окраска цист: в конце созревания они не приобретают золотистый цвет, как у G. rostochiensis, а остаются бледными. Цисты обоих видов могут выживать в почве без растений-хозяев до 10 лет (Sijmons, 1993; Williamson, Hussey, 1996). Основными симптомами поражения являются угнетение роста растения, иногда пожелтение или отмирание листьев, уменьшение размеров клубней и сильное разветвление корней.

Нематоды не имеют как таковых естественных переносчиков, но могут распространяться с клубнями картофеля, частицами почвы, которые могут переноситься сельскохозяйственной техникой.

В настоящее время, по данным EPPO, G. rostochiensis распространена во всех странах Европы, в том числе и на территории сопредельных стран, таких как Беларусь, Латвия, Эстония, Литва, Украина, Армения; на Азиатском континенте в Таджикистане, Японии и Индии. G. pallida не обнаружена на территории РФ, хотя широко распространена в Европе. По данным ЕРРО, G. pallida зарегистрирована во всех странах Европы, кроме Беларуси, Латвии, Литвы, Польши и Словакии.

G. pallida и G. rostochiensis включены в список A2 перечня вредителей Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений. На территории РФ G. pallida включена в первый список единого перечня карантинных объектов Евразийского экономического союза.

Набор реагентов «Globodera rostochiensis и Globodera pallida-РВ»

Набор реагентов для дифференциальной диагностики и выявления ДНК бледной и золотистой нематоды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала и почв, в целях обнаружения ДНК Globodera pallida и Globodera rostochiensis. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце ДНК Globodera pallida и Globodera rostochiensis.

При амплификации методом ПЦР-РВ в наборе используются два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих специфический фрагмент ДНК Globodera rostochiensis и Globodera pallida, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих ДНК внутреннего положительного контроля ПЦР-РВ, а также три флуоресцентных зонда. Процесс амплификации специфичных фрагментов заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой с детекцией результатов в режиме реального времени.

Набор реагентов «Globodera rostochiensis и Globodera pallida-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный для Globodera pallida фрагмент гена (по каналу флуоресценции FAM/Green) и специфичный для Globodera rostochiensis фрагмент гена (по каналу флуоресценции ROX/Orange), а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции Cy5/Red. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

Чувствительность

При выделении ДНК из одной цисты Globodera rostochiensis и/или Globodera pallida набором реагентов EX-511 ДНК-Экстран-2 (Синтол, Россия; основан на тотальном осаждении и лизисе SDS) пороговый цикл составил 19,4 для каждой из матриц ДНК.

Специфичность

Ложноотрицательные результаты при анализе образцов, содержащих ДНК целевого объекта, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов, не содержащих специфические фрагменты ДНК Globodera rostochiensis и Globodera pallida, отсутствовали.

Апробация и примеры анализа

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).