Начните с задачи
Для рутинных и чувствительных применений могут требоваться разные уровни очистки.
Чистота продукта
Выберите очистку под применение олигонуклеотида
Метод очистки определяет, насколько полноразмерный продукт отделён от побочных продуктов синтеза. Выбор зависит от длины, модификаций и требований эксперимента.
Изучить параметр
Выбрать в конструкторе
Отправить запрос
Учитывайте конструкцию
Длина и модификации влияют на требования к отделению целевого продукта.
Не путайте с QC
Очистка получает продукт нужного качества, а контроль подтверждает выбранные характеристики.
Технология очистки
Почему длина и химия последовательности меняют требования к очистке
Каждый цикл синтеза проходит с высокой, но не абсолютной эффективностью. Поэтому вместе с целевой цепью образуются укороченные продукты; их доля увеличивается с длиной олигонуклеотида.
Даже небольшая потеря на каждом цикле накапливается по мере удлинения цепи.
Расчётный пример для последовательного синтеза без последующей очистки.
Для длинной цепи доля укороченных продуктов становится существенно выше.
Фактический результат зависит от длины, состава, модификаций и выбранного метода.
Задача очистки
Отделить полноразмерный продукт от n−1, n−2 и других примесей
Очистка не меняет последовательность: она уменьшает долю укороченных цепей, непрореагировавших компонентов и побочных продуктов синтеза.
Длина
Чем больше циклов синтеза, тем выше накопленная вероятность неполного присоединения.
Модификации
Красители, гасители и другие группы могут потребовать дополнительного разделения непрореагировавших компонентов.
Чувствительность метода
В ПЦР и других чувствительных задачах примеси могут снижать специфичность, чувствительность и стабильность результата.
Количество продукта
Метод выбирают не только по чистоте, но и по требуемому выходу после очистки.
ПААГ
Разделение по длине в денатурирующем полиакриламидном геле
Электрофорез позволяет идентифицировать полноразмерную цепь относительно маркеров длин. Денатурирующие условия уменьшают влияние вторичных структур.
Как работает
Разделение идёт преимущественно по молекулярной массе и длине; целевую полосу выделяют из геля, затем продукт обессоливают.
Условия
Используются 10–20% полиакриламидные гели и 7 М мочевина; концентрацию измеряют при 260 нм.
Ориентир чистоты
Для коротких цепей менее 25 звеньев описан диапазон 95–99%, для длинных более 30 звеньев — 85–90%.
Ограничения
Метод рассчитан на сравнительно небольшие количества, а G-богатые цепи могут сохранять стабильные вторичные структуры.
ВЭЖХ
Хроматографическое разделение по гидрофобности
Обращённо-фазовая ВЭЖХ использует различия в удерживании DMT-содержащего полноразмерного продукта и более коротких цепей.
Как работает
После выделения целевой фракции DMT-группу удаляют, продукт обессоливают и при необходимости подтверждают чистоту аналитическим гелем.
Масштаб
Метод подходит для получения больших количеств очищенного материала.
Ориентир чистоты
Для обращённо-фазовой ВЭЖХ описан диапазон порядка 90–95%.
Ограничения
Разделение может ухудшаться для последовательностей длиннее 50 звеньев и для G-богатых цепей со стабильной вторичной структурой.
Практические вопросы
Перед выбором параметров
Всегда ли самый сложный метод очистки лучше?
Нет. Нужно сопоставить чувствительность применения, длину, модификации, требуемый выход и доступные варианты.
Очистка подтверждает молекулярную массу?
Нет. Очистка разделяет продукты; подтверждение массы относится к контролю качества.
Почему G-богатые последовательности сложнее?
Они могут образовывать устойчивые вторичные структуры, которые ухудшают разделение даже в денатурирующих условиях.
Как выбрать очистку
На этой странице показываются только варианты, реально доступные в справочнике сайта.
ПААГ + ВЭЖХ
Комбинированная очистка для конструкций, где важны длина и химическая чистота.
Когда применять
- Двойные модификации
- Ответственные диагностические задачи
Когда не выбирать
- Когда комбинации нет среди активных вариантов
Показывается только при наличии такого варианта в справочнике.
ПААГ
Гель-очистка отделяет полноразмерный продукт от укороченных последовательностей.
Когда применять
- Олигонуклеотиды средней длины
- Строгие требования к полноразмерности
Когда не выбирать
- Когда нужна хроматографическая оценка чистоты
Выбор зависит от длины и конструкции олигонуклеотида.
ВЭЖХ
Хроматографическая очистка для модифицированных и меченых олигонуклеотидов.
Когда применять
- Флуорофоры и гасители
- Гидрофобные модификации
Когда не выбирать
- Когда выбранный вариант отсутствует в справочнике
Используйте только доступные варианты из справочника ниже.
Без очистки
Активный вариант из текущего справочника.
Когда применять
- Когда этот вариант соответствует требованиям вашей задачи
Когда не выбирать
- Если требования эксперимента предполагают другой метод
Точные ограничения и условия уточняйте по описанию справочника и в редакторе заказа.
Доступные варианты очистки на сайте
Следующий шаг
Выберите очистку в конструкторе заказа
Добавьте последовательность, задайте параметры и сравните предварительную стоимость доступных вариантов.