Определение концентрации олигонуклеотида

Введение

Концентрация олигонуклеотида наиболее точно и легко определяется путем измерения УФ-поглощения образца при 260 нм с использованием спектрофотометра. В соответствии с законом Ламберта-Бера:

A = ε x С x l

где
А - поглощение (ое),
ε - молярный коэффициент поглощения (М^-1см^-1),
С - концентрация (М),
l - длина оптического пути (см).

Измерение А производится при определенной длине волны, температуре, составе буфера, которые влияют на значение e.

Определение

Поглощение (А), измеренное при 260 нм в кювете с длинной оптического пути 1 см, равно количеству олигонуклеотида в 1 мл воды. Концентрация олигонуклеотида в растворе зависит от длины и последовательности, которые определяют значение суммарного молярного коэффициента поглощения (e).

В соответствии с законом Ламберта-Бера концентрация олигонуклеотида может быть легко вычислена, если известно его поглощение и молярный коэффициент поглощения.

Пуриновые и пиримидиновые основания ДНК и РНК поглощают свет с максимумом в области 260 нм. При этом бициклические основания (пурины: аденин и гуанин) более сильные хромофоры (имеют более высокий молярный коэффициент поглощения), чем моноциклические (пиримидины: цитидин, тимидин и урацил). Это необходимо учитывать при расчете концентрации, которая при одинаковом поглощении будет различаться для олигонуклеотидов разного состава.

Точные молярные коэффициенты поглощения представлены в таблице:

Кроме состава олигонуклеотида, на значение молярного коэффициента поглощения оказывают влияние стэкинг-взаимодействия гетероциклических оснований в одноцепочечном олигонуклеотиде, т. е. по сути, - последовательность олигонуклеотида.

Компания СИНТОЛ для расчета значения молярного коэффициента поглощения использует специальную программу, которая учитывает состав и последовательность Вашего олигонуклеотида и, таким образом, позволяет наиболее точно определить концентрацию олигонуклеотида в растворе.

Например, молярный коэффициент поглощения тетрануклеотида ACGT будет равен сумме попарных молярных коэффициентов поглощения:

Попарные молярные коэффициенты поглощения (ое/ммоль) представлены в таблице:

Таким образом, зная значение поглощения, А, (показатель спектрофотометра) и вычислив значение молярного коэффициента поглощения, e, мы рассчитываем концентрацию олигонуклеотида в растворе (мкМ) по уравнению Ламберта-Бера.

Для того чтобы получить концентрацию олигонуклеотида в мкг/мкл, необходимо посчитать молекулярный вес олигонуклеотида, в соответствии с его составом (значения молекулярного веса каждого из нуклеотидов представлены в таблице) и затем вычислить концентрацию по формуле:
C(мкг/мкл) = C(M) x MW

Заключение

Для каждого олигонуклеотида, который Вы заказываете у нас, в Паспорте на олигонуклеотиды приводятся значения:
- концентрации в мкМ,
- концентрации в мкг/мкл.

За дополнительной информацией об олигонуклеотидах обращайтесь в компанию СИНТОЛ.