Линейные зонды

Линейные зонды

1. Линейный зонд, меченный по концам с разным взаимным расположением красителей:

Первая комбинация является наиболее популярной, так как гаситель флуоресценции более объёмная молекула, чем флуорофор и, за счёт стерического фактора, затрудняющего работу фермента, результирующее значение порогового цикла смещается в большую сторону.
Вторая комбинация используется в случаях, когда на 5' конце зонда гуанозин (G), а используемый флуорофор карбоксифлуоресцеин (FAM), так как известно, что эффект гашения FAM 5'-концевым гуанозином может быть от 30 до 70%.

2. Линейный зонд, содержащий одну из меток внутри олигонуклеотидной цепи (X - внутренний нуклеотид, обычно тимидин):

Использование зондов такой структуры рекомендуется в случаях, когда:

• Длина зонда превышает 25 нуклеотидов;
• Необходимо иметь более низкое значение фоновой флуоресценции, что особенно важно при детекции по конечной точке, а также важно для проведения мультиплексных реакций.

Расстояние между флуорофором и гасителем не должно быть меньше 5-6 нуклеотидов из-за возможности отщепления полимеразой фрагмента зонда, содержащего оба красителя, что не приводит к ожидаемому разгоранию сигнала флуоресценции.
Первый вариант зонда является более популярным.
Сотрудниками компании Синтол разработана серия гасителей флуореcценции RTQ (real-time quenchers) - RTQ-1 (520 нм), RTQ-1.5 (575 нм), RTQ-2 (625 нм), которые обладают лучшими характеристиками по сравнению с гасителями BHQ (black hole quenchers) производства компании Biosearch Technologies (США).

Основные преимущества гасителей RTQ, по сравнению с BHQ:

• Лучшая эффективность гашения флуоресценции зондов (в 1,2-2 раза);
• Более низкие значения фоновой флуоресценции зондов (от 1,2 до 3 раз).