Наборы реагентов для диагностики туберкулёза

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.

«Амплитуб» — технология быстрой молекулярно-генетической диагностики туберкулёза для выявления микобактерий туберкулёзного комплекса, определения инфекционной опасности больного, определения антибиотикоустойчивости к препаратам I и II ряда, идентификации и генотипирования микобактерий.

Технология «Амплитуб» состоит из 3-х основных этапов: пробоподготовки, выделения ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Оригинальные технологические разработки нашей компании применяются на каждом из этих этапов и в совокупности обеспечивают высочайшую чувствительность, специфичность и информативность анализа, быстроту получения результатов и их высокую достоверность.

I этап

Пробоподготовка: в процессе инкубации с «Амплитуб-Преп» происходит инактивация микобактерий, разжижение и гомогенизация респираторных образцов.

II этап

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

III этап

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

Преимущества технологии «АМПЛИТУБ»

Скорость
Технология «Амплитуб» позволяет сократить время, необходимое для обнаружения M.tuberculosis complex и определения лекарственной устойчивости с 1-3 месяцев до 1 дня в сравнении с традиционными культуральными методами.

Высокая достоверность результатов
Высокая достоверность результатов обеспечивается как на этапе обнаружения МБТ, так и на этапе определения антибиотикоустойчивости. Применение технологии «Амплитуб» позволяет обнаружить МБТ с высокой чувствительностью (не более 100 КОЕ/мл мокроты) и 100% специфичностью. Точное определение мутаций в наиболее значимых кодонах основных генов, ассоциирующихся с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, позволяет определить 90% антибиотикоустойчивых образцов со специфичностью, близкой к 100%.

Безопасность
Клинические образцы инактивируются с помощью «Амплитуб-Преп» уже на этапе взятия и транспортировки биологического материала.

Возможность работы с клиническими образцами
Важным преимуществом технологии «Амплитуб» является возможность исследования не только культур микобактерий, но и непосредственно клинического материала (мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей).

Автоматизация
Роботизированная станция TECAN и набор реагентов «М-Сорб-Туб-Автомат» позволяют полностью автоматизировать наиболее трудоёмкий этап выделения ДНК. Технология «Амплитуб» обеспечивает автоматический расчет результатов ПЦР-анализа с указанием количества выявленного возбудителя в образце и конкретных мутаций, определяющих устойчивость к антибиотикам.

I этап – Пробоподготовка, инактивация

«Амплитуб-Преп» (инактивирующий реагент) специально адаптирован для обработки мокроты. Обладает исключительными муколизирующими свойствами, благодаря которым может использоваться вместо раствора NALC-NaOH для обработки мокроты перед молекулярно-генетическими исследованиями.

		Биологическая безопасность работы в ПЦР-лаборатории Полностью убивает микобактерии в • клиническом материале (мокрота, промывные воды бронхов, спинномозговая жидкость, экссудат, пунктат, биоптат, моча, отделяемое половых путей); • материале, предварительно деконтаминированном стандартными методами; • культуре клеток

		Увеличение чувствительности ПЦР-анализа • обладает исключительными муколизирующими свойствами; • повышает эффективность выделения ДНК по сравнению со стандартной предобработкой NALC-NaOH более, чем в 10 раз

		Полная сохранность ДНК при транспортировке и хранении клинического материала в течение 1 месяца

Клинический образец
+
«Амплитуб-Преп»
(в соотношении 1:1)

перемешать и инкубировать не менее 30 минут

взять 1 мл инактивированного образца

центрифугировать 5 минут при 10 000 об/мин

выделить ДНК

Клинические и технические испытания «Амплитуб-Преп» (инактивирующего реагента) проводились в ЦНИИ туберкулёза (Москва). 118 образцов мокроты от тяжёлых бациллярных больных с острым течением туберкулёза делили на две части, обрабатывали одну часть «Амплитуб-Преп», другую — NALC-NaOH.
Все образцы тестировали на BACTEC MGIT 960 и методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Рост микобактерий наблюдался только в контрольной группе, обработанной NALC-NaOH. В образцах, обработанных «Амплитуб-Преп», рост микобактерий не обнаружен. Результаты ПЦР-анализа образцов из обеих групп были положительными.

II этап – Выделение ДНК

Компанией Синтол разработан ряд наборов реагентов для выделения ДНК микобактерий.

«М-Сорб-Туб» («Амплитуб-РВ» комплект №1)
Набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

Адаптирован для выделения ДНК микобактерий из мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей, культур клеток.
Набор «М-Сорб-Туб» обеспечивает лизис клеток, сорбцию ДНК на магнитных частицах, осаждение ДНК центрифугированием, промывку и элюцию ДНК.
Предлагаемая компанией «Синтол» методика выделения ДНК сочетает в себе достоинства сорбционного метода и метода осаждения спиртом.
Использование в качестве сорбента покрытых оксидом кремния магнитных частиц более удобно в сравнении с использованием других сорбентов, позволяет максимально стандартизировать и автоматизировать методику выделения ДНК.
В каждый исследуемый образец добавляется внутренний положительный контроль (ВПК), по реакции амплификации ВПК судят о наличии/отсутствии ингибиторов ПЦР и эффективности выделения ДНК.

«М-Сорб-Туб-Автомат» («Амплитуб-РВ» комплект №1а; №1в)
Набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

Набор представляет собой модификацию набора реагентов «М-Сорб-Туб», разработанную специально для использования на автоматизированных станциях фирмы TECAN, что обеспечивает ряд следующих преимуществ.

Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

«Экстра-Туб»
Набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

Совмещение процесса пробоподготовки и выделения ДНК из образцов мокроты позволяет провести эти два этапа работы за 1 час.
Минимальное количество манипуляций при пробоподготовке и выделении ДНК. Набор состоит из 3 рабочих растворов: «Амплитуб-Преп», лизирующего и элюирующего растворов.
Использование «Амплитуб-Преп» в составе набора «Экстра-Туб» позволяет увеличить выход ДНК в 5‑10 раз.

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

Набор реагентов АМПЛИТУБ-РВ — это:

высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).

Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Ниже представлен перечень производимых нами наборов серии «Амплитуб»

Амплитуб-Преп — реагент для предобработки образцов, предположительно содержащих ДНК микобактерий (кат.№R-001) Регистрационное удостоверение № РЗН 2017/6634
АМПЛИТУБ-РВ — набор реагентов для для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (кат. № ОМ-200а и ОМ-200ат (для автоматизированной станции TECAN)) Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07635.
Амплитуб МБТК + НТМБ — набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса (МБТК) и нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ)
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ — набор реагентов для определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёзного комплекса к рифампицину и изониазиду методом ПЦР в реальном времени (кат. № ОМ-400) Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07636.
АМПЛИТУБ-FQ-РВ — набор реагентов для выявления генетических маркеров ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам, методом ПЦР в реальном времени (кат. № ОМ-800) Регистрационное удостоверение № РЗН 2017/5772
АМПЛИТУБ-ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ — набор реагентов для дифференциации видов микобактерий, входящих в M.tuberculosis complex (M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG и др. виды) (кат. № ОМ-114)
АМПЛИТУБ-Beijing — набор реагентов для определения генотипа Beijing микобактерий туберкулёза (кат.№ ОМ-115)
«Экспресс-Туб» — набор реагентов для быстрого выделения ДНК микобактерий из культур клеток (кат. № ОМ-518)

В 2006 году в НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова совместно с ЗАО «Синтол» был проведен скрининг более 2000 клинических образцов культур МБТ из 25 регионов Российской Федерации. Процент МЛУ-MБТ штаммов (к рифампицину и изониазиду), полученных от впервые выявленных пациентов, составил 21,9%, а процент MЛУ-MБТ штаммов, полученных от ранее леченных больных, был 58,5%. Совпадение результатов с данными микробиологического анализа составило 94%. В рамках мониторинга был проведен молекулярно-генетический анализ диапазона и частоты встречаемости различных кодонов и мутаций в генах МБТ, ответственных за устойчивость к рифампицину и изониазиду.
В 2007 году проведены клинические испытания наборов по определению устойчивости к рифампицину и изониазиду.
В 2008–2011 годах проведена апробация наборов по определению устойчивости к препаратам резервного ряда (фторхинолонам, капреомицину, амикацину). В 2010 году разработан и испытан «Инактивирующий реагент А».
В настоящее время он продаётся под торговой маркой «Амплитуб-Преп».
В 2014–2017гг. в сотрудничестве с ФГБНУ «ЦНИИТ» разработан набор «Амплитуб-МБТК+НТМБ», позволяющий в 1 пробирке обнаружить ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса и ДНК нетуберкулёзных микобактерий (без определения конкретного вида НТМБ).
В настоящее время ведётся разработка набора, позволяющего определять наиболее актуальные для российской популяции виды НТМБ.

Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере 531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости
Гены	Кодоны	Замены
rpoB	531	Ser – Leu TCG – TTG
	531	Ser – Trp TCG – TGG
	526	His – Tyr CAC – TAC	His – Arg CAC – CGC
		His – Asp CAC – GAC	His Asn CAC – AAC
		His – Leu CAC – CTC	His – Pro CAC – CCC
	516	Asp – Val GAC – GTC
	516	Asp – Tyr GAC – TAC
	533	Leu – Pro CTG – CCG
katG	315	Ser – Thr AGC – ACC
		Ser – Asn AGC – AAC
		Ser – Thr AGC – ACA
inhA	209	C209T
embB	306	Met – IIe ATG – ATA	Met – Val ATG – GTG
embB	306	Met – Leu ATG – CTG	Met – IIe – ATG – ATC
gyrA	90	Ala – Val GCG – GTG
	94	Asp – Asn GAC – AAC	Asp – Ala GAC – GCC
	94	Asp – Gly GAC – GGC	Asp – Tyr GAC – TAC

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

В 2011 году по инициативе сотрудников лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ЦНИИТ РАМН группа разработчиков из ЦНИИТ под руководством профессора Черноусовой Ларисы Николаевны и «Синтола» впервые в России внедрила в лабораторную практику высокопроизводительную автоматизи-рованную систему выделения ДНК микобактерий на платформе Freedom EVO (TECAN) с использованием наборов реагентов «Амплитуб». Это позволило значительно сократить трудоёмкость ПЦР-диагностики туберкулёза и увеличить поток анализов.

Время анализа МБТ при использовании автоматизированных станций Freedom EVO («TECAN», Швейцария) и наборов реагентов «Амплитуб» («СИНТОЛ», Россия)

Устройство автоматизированной станции Freedom EVO («TECAN», Швейцария) показано ниже:

Выбирая технологию «Амплитуб» («Синтол») на платформе Freedom EVO («TECAN»), Вы получаете:

Обнаружение возбудителя туберкулёза — 48 образцов за 3 часа.
Определение лекарственной устойчивости к препаратам I и II ряда за 1 день.
Уменьшение трудозатрат в 6 раз.
Увеличение производительности лаборатории.
Безопасность работы благодаря «Амплитуб-Преп».
Стандартизованное выделение ДНК.
Снижение риска контаминации лаборатории.
Низкую себестоимость 1 анализа.
Признательность фтизиатров за быструю и точную диагностику!

Наборы реагентов для диагностики туберкулёза