Выявление ДНК возбудителя фитофтороза древесных и кустарниковых культур с помощью набора реагентов «Phytophthora ramorum-РВ»

Набор реагентов «Phytophthora ramorum-РВ»

Phytophthora ramorum — опасный фитопатогенный гриб, вызывающий фитофтороз древесных и кустарниковых культур. P. ramorum входит в список А2 перечня вредителей Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений.

Предположительно центром происхождения вида P. ramorum является Вьетнам, откуда этот вид был интродуцирован в Европу и Северную Америку (Jung et al., 2020). На сегодняшний день P. ramorum встречается в Бельгии, Хорватии, Дании, Финляндии, Франции, Германии, Греции, Ирландии, Люксембурге, Нидерландах, Норвегии, Польше, Португалии, Сербии, Словении, Швейцарии, Великобритании, Вьетнаме, Канаде, США.

Важную роль в распространении патогена играет мицелий, способный образовывать споры трёх различных типов: зооспоры, спорангии и хламидоспоры. Другой способ инфицирования — заражённая почва или питательный субстрат. Патоген колонизирует проводящую систему растений.

Характерными симптомами поражения P. ramorum являются наличие на стволе деревьев смолистых пятен или язв и появление некротизированных обесцвеченных тканей коры. Окклюзия сосудов, вызванная данным патогеном, часто приводит к увяданию листьев/хвои и в конечном итоге к гибели растения. Поражение ветвей начинается с кончиков и по мере прогрессирования инфекции движется к их основанию. Язвы могут появляться на побегах, стеблях и способны приводить к быстрому увяданию листьев, при этом увядшие листья не отпадают. Другим важным симптомом является появление небольших коричневых или чёрных пятен на листовой пластине, при этом со временем площадь поражения разрастается и охватывать весь лист целиком. В этом случае листья могут преждевременно опадать (Bulletin OEPP/EPPO, 2006:36).

P.ramorum способен нанести существенный экономический ущерб лесам и питомникам. Ситуацию осложняет наличие широкого круга растений-хозяев, поскольку виды растений, формирующих подлесок (например, Laurus nobilis), также могут быть инфицированы P. ramorum и способствуют выживанию и сохранению вида (Grünwald et al., 2019). В настоящее время известно более 170 видов, поражаемых данным патогеном. К ним относятся кустарники и деревья, а также некоторые травянистые растения: Camellia, Kalmia latifolia, Larix, Lithocarpus densiflorus, Quercus agrifolia, Pieris, Rhododendron, Syringa vulgaris, Vaccinium and Viburnum (Bulletin OEPP/EPPO, 2006:36).

«Phytophthora ramorum-РВ»

Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя фитофтороза древесных и кустарниковых культур методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения Phytophthora ramorum. Набор реагентов позволяет качественно определить, содержится ли в образце ДНК Phytophthora ramorum, а также Phytophthora foliorum, растением-хозяином которого является азалия, Rhododendron sp.

Набор реагентов «Phytophthora ramorum-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент ДНК Phytophthora ramorum — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow/VIС. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Специфичность
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов, содержащих ДНК Phytophthora ramorum и Phytophthora foliorum, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов, не содержащих специфические фрагменты ДНК Phytophthora ramorum и Phytophthora foliorum, отсутствовали.
  
  В качестве подтверждающего метода для идентификации возбудителя фитофтороза древесных и кустарниковых культур Phytophthora ramorum желательно использовать метод секвенирования на праймерах, рекомендуемых EPPO (PM 7/66 (1)) – ITS1: 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′
  ITS 4: 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′ (Whiteet al., 1990).
  
  С помощью метода секвенирования с указанными праймерами можно тестировать только ДНК из чистых культур, в противном случае в той же реакции могут быть амплифицированы последовательности из нескольких организмов.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США).

Примеры анализа на выявление ДНК возбудителя фитофтороза древесных и кустарниковых культур с использованием набора реагентов «Phytophthora ramorum-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: