Дифференциальная диагностика и выявление РНК вирусов картофеля с помощью набора реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ»

Набор реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ»

Картофель относится к числу культур, сильно поражаемых вирусными болезнями, что было замечено сразу после его интродукции в Европу в 16 веке (Лебенштейн и др., 2000). Potato Virus M повсеместно встречается в посадках картофеля. Симптоматика поражения зависит от сортовых особенностей и изолята, варьирует от слабой мозаики до сильного закручивания верхних листьев и остановки роста растений. В соответствии с нуклеотидной последовательностью гена, кодирующего белок оболочки вируса, 11 изолятов вируса распределяются на две группы, одна из которых включает PVM изоляты из Италии, Германии, Китая, Польши и России, а вторая — изоляты из США и Канады (Xu et al., 2010).

Potato Virus S также встречается во всех регионах, где выращивают картофель. Имеет узкий круг хозяев — в основном представителей двух семейств: Solanaceae и Chenopodiaceae. У большинства инфицированных сортов картофеля симптомы вирусного поражения не проявляются. Андийский штамм PVSA, в отличие от широко распространенного PVSo, вызывает более серьёзное поражение, приводящее к преждевременному отмиранию листьев, и эффективнее переносится тлями. Новый изолят SBK, поражающий культурный картофель вида S. phureja, недавно обнаружен в Колумбии (Gutierrez et al., 2013).

Повсеместное распространение и наиболее ощутимый ущерб картофелеводству причиняет Potato Virus Y, который имеет широкий круг хозяев, поражает растения 9 семейств, в том числе представителей 9 родов Solanacea. Симптомы поражения на картофеле варьируют в зависимости от сорта, штамма вируса и условий выращивания. Различают три группы штаммов: обыкновенный PVYo, распространённый во всех странах; некротический PVYN, поражающий картофель в Европе, странах Африки и Южной Америки; PVYC — штамм, обнаруженный в Европе, Австралии и Индии. Некротический штамм подразделяют на группы PVYN, PVY NTN и PVY N-Wi. Изоляты группы PVY NTN вызывают появление некрозов в мякоти клубней. Изоляты группы PVY N-Wi серологически сходны с изолятами обыкновенного штамма PVYo. Полагают, что их геном — результат рекомбинации между изолятами некротического и обыкновенного штаммов, которая произошла сравнительно недавно в результате специализации патогена к паразитированию на определённых сортах картофеля (Visser et al., 2012).

«Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ»

Набор реагентов для дифференциальной диагностики и выявления РНК вирусов картофеля методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

• Область применения
  Набор реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ» предназначен для обнаружения РНК вирусов S, Y и M картофеля. Данные вирусы помимо картофеля поражают многие растения рода Solanum, в том числе такие важные сельскохозяйственные культуры, как томат, баклажан, сладкий перец и табак.
  
  Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК вирусов картофеля. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК вирусов картофеля S, Y, M.

Диагностика растений с помощью набора «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ» возможна на всех этапах вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций. Набор реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичные фрагменты S, M и Y вирусов картофеля: S вирус картофеля — по каналу флуоресценции FAM/Green, M вирус — по каналу флуоресценции ROX/Orange, Y вирус — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции Cy5/Red.

• Чувствительность
  Для испытания аналитической чувствительности набора был произведен ряд из восьми разведений полученной РНК изолятов PV-0403 (pvY), PV-0574 (pvS) и PV-0273 (pvM) средней заражённости (20,8 ct). Положительная реакция наблюдалась при разведении исходного инокулюма в 10⁵ раза. При разведении в 10⁶ раз реакция была нестабильной. При разведении в 10⁷ раз специфичной реакции не отмечено.
  
  При постановке ПЦР в мноплексе (каждый вирус отдельно) отличий, а именно снижений аналитической чувствительности, не обнаружено. Результаты приведены на рисунках ниже.
• Специфичность
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК целевых вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих вышеперечисленные специфичные фрагменты, отсутствовали.

Сравнение аналитической чувствительности моноплексных ПЦР-реакций для выявления вирусов картофеля и ПЦР-реакций при использовании мультиплексного набора реагентов «Potato Virus M, Potato Virus Y, Potato Virus S-РВ»: