Обнаружение РНК вируса кольцевой пятнистости табака с помощью набора реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ»

Набор реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ»

Вирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus, TRSV) относится к IV группе (+)ssRNA семейства Secoviridae, род Nepovirus. Впервые TRSV был обнаружен в США на табачных плантациях в штате Вирджиния и описан в 1927 году. На сегодняшний день вирус включён в список А2 ЕОКЗР и во второй список единого перечня карантинных объектов Евразийского экономического союза.

TRSV паразитирует на широком круге одно- и многолетних видов растений. В экспериментальных условиях для TRSV выявлено 89 видов растений-хозяев из 27 ботанических семейств. TRSV вызывает серьёзные болезни сои, табака, винограда, голубики (особенно Vaccinium corymbosum) и тыквенных культур. В число природных растений – хозяев вируса входят: плодовые культуры, виноград, ягодные культуры, овощные, бахчевые и зернобобовые культуры, древесные и кустарниковые декоративные и лесные растения, декоративные травянистые растения.

Самой вредоносной болезнью, индуцируемой TRSV, считается поражение (отмирание) почек сои (Soyabean bud blight). Наиболее характерным симптомом болезни является искривление вниз верхушечных почек в виде крючка. Позднее остальные почки становятся коричневыми, некротизированными и хрупкими. На заражённых растениях фасоли TRSV в начале вегетации индуцирует симптомы хлоротической кольцевой пятнистости и крапчатости, некрозы и деформации листьев. Из растений тыквенных культур чаще всего заражает огурец и дыню. Заражённые TRSV растения данных видов угнетаются, на первых листьях развивается ярко-жёлтая мозаика, последующие листья приобретают тёмно-зелёную окраску, уменьшены по величине и деформированы.

«Tobacco ringspot virus-РВ»

Набор реагентов для обнаружения РНК вируса кольцевой пятнистости табака методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Набор реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ» предназначен для обнаружения РНК вируса кольцевой пятнистости табака. Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК Tobacco ringspot virus.

Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Tobacco ringspot virus. Диагностика растений на наличие вируса кольцевой пятнистости табака с помощью набора «Tobacco ringspot virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций.

Набор реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент Tobacco ringspot virus — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Первая реакция позволяет обнаружить ген оболочки (cp) вируса Tobacco ringspot virus. Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% целевых вирусов, последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 15.02.2020 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Чувствительность
  Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Tobacco ringspot virus» не менее 3,0*10³ копий ДНК в миллилитре пробы
• Специфичность
  При проверке на специфичность использовались РНК близкородственных, сопутствующих и целевых штаммов вирусов следующих коллекций: DSMZ, Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»).
  
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК целевых вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» («Qiagen»), «DT» («ДНК-технология», Россия).

Примеры анализа на выявление РНК вируса кольцевой пятнистости табака с использованием набора реагентов «Tobacco ringspot virus-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: