Выявление ДНК возбудителя бактериальной полосатости листьев риса с помощью набора реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ»

Набор реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ»

Бактериальная полосатость листьев риса (Bacterial leaf streak, BLS) широко распространена в тропических зонах Азии: Бангладеш, Камбоджа, Китай, Индия, Индонезия, Лаос, Мьянма, Непал, Пакистан, Филиппины, Таиланд, Малайзия. В последнее время данная болезнь стала существенной проблемой для стран Африки: Мадагаскар (Buddenhagen, 1985), Нигерия, Сенегал. Австралия – северные территории, в Европе BLS не обнаружена (EPPO Data sheet on Xanthomonas oryzae).

Возбудитель бактериальной полосатости риса (BLS) относится к бактериям рода Xanthomonas, а именно Xanthomonas oryzae патовариант (pv.) oryzicola. Включен в список А1 перечня ЕОКЗР.

X. oryzae pv. oryzicola – грамотрицательная бактерия с одним полярным жгутиком. Ее размер составляет 1,0–2,5 х 0,4–0,6 мкм. Колонии медленно растущие, обычно бледно-желтые, круглые, гладкие, цельные, куполообразные, слизистые. Основным растением-хозяином является рис Oryza sativa. Бактерии также поражают ряд диких культур и незначительное число культивируемых злаков (Leersia spp., Leptochloa spp., Oryza spp., Paspalum scrobiculatum, Zizania, Zoysia spp.), а также сорные растения, которые могут выступать переносчиками (Li et al., 1985). Передается зараженными семенами. Распространение происходит за счет контакта между растениями, с дождевой и поливной водой. Бактерии могут сохраняться от сезона к сезону на листьях инфицированных растений и растительных остатках, но не выживают в нестерильной почве (Devadath & Dath, 1970).

Симптомы бактериальной полосатости листьев могут проявляться на любой стадии роста растения-хозяина. X. oryzae pv. oryzicola проникают через устьица и размножаются в тканях паренхимы листьев. Бактерии легко проникают в ткани, поврежденные насекомыми-вредителями (EPPO/CABI,1992). Первоначальные симптомы – появление небольших водянистых межжилковых штрихов, которые со временем могут увеличиваться в размерах и темнеть. Узкие, длинные, полупрозрачные очаги могут сливаться, формируя большие пятна. Именно на этом этапе листья буреют и засыхают, что приводит к гибели растения. Заболевание бывает сложно отличить от бактериального ожога листьев, однако, X. oryzae pv. oryzicola поражает в основном паренхиму клеток листьев, но не носит системного характера (Ou, 1985).

«Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ»

Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя бактериальной полосатости листьев риса методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ» предназначен для обнаружения ДНК Xanthomonas oryzae pv. oryzicola – возбудителя бактериальной полосатости листьев риса.

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль карантинного фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала в целях обнаружения ДНК Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце ДНК Xanthomonas oryzae pv. oryzicola.

Диагностика растений с помощью набора «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Набор реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент ДНК Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (по каналу флуоресценции ROX/Orange), а также внутренний положительный контроль – по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow/VIK. Вторая реакция – ВПК (Внутреннего Положительного Контроля) – необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Чувствительность
  Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ» не менее 15*10³ копий ДНК в миллилитре пробы.
• Специфичность
  Специфичность — ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих ДНК целевой бактерии, отсутствовали, ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и ДНК бактерий, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали, в том числе при внесении в реакцию ДНК Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene Q/6000» (Qiagen/Corbett, США/Австралия), «DT» («ДНК-технология», Россия), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США).

Примеры анализа на выявление ДНК возбудителя бактериальной полосатости листьев риса с использованием набора реагентов «Xanthomonas oryzae pv. oryzicola-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: