Обнаружение РНК вируса штриховатой мозаики ячменя с помощью набора реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ»

Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ»

Вирус штриховатой мозаики ячменя (Barley stripe mosaic virus — BSMV), типичный и наиболее изученный представитель группы Hordeiviruses, поражающий зерновые культуры, представляет собой палочкообразный РНК-содержащий вирус с многокомпонентным геномом.

Все геномные РНК BSMV несут на З'-конце тРНК-подобную структуру, способную акцептировать тирозин и внутренний ро1у (А)-блок разной длины. Капсид BSMV построен из идентичных белковых субъединиц, расположенных по спирали. Белок оболочки BSMV, ген которого локализован на 5'-концевом участке одной из геномных РНК (РНК2а), является гликопротеином и способен к реполимеризации с образованием стабильных промежуточных белковых агрегатов, а также может инкапсулировать чужеродную РНК. BSMV способен индуцировать мутации в растении-хозяине.

Согласно литературным данным, вирус штриховатой мозаики ячменя широко распространен во всём мире. Его естественные хозяева — пшеница (Triticum aestivum), ячмень (Hordeum vulgare), овес (Avena sativa), кукуруза (Zea mays), однако она до сих пор не была включена в список характерных хозяев этого вируса. В США и Канаде BSMV давно классифицирован как карантинный объект, поскольку патоген передается через посевной материал. В 2016 г. был включен Европейско-Средиземноморской организацией по карантину и защите растений (ЕОКЗР) в список А2 (PM1 / 002 (28) карантинных объектов (https://www.eppo.int) (PM3 / 034 (1)), (PM3 / 078 (1)).

По данным лаборатории вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, BSMV широко распространен на территории Приморского края. Даже в благополучные в эпидемиологическом отношении годы его встречаемость в рядовых посевах яровой пшеницы и ярового ячменя достигает 3%. В условиях этого региона озимые зерновые культуры более чувствительны к инфекции, чем яровые.

Проявление симптомов на заражённых растениях зависит от штамма вируса, сорта растения-хозяина и факторов окружающей среды. Проявление симптомов усиливается при повышении температуры (24–30 °C).

В зависимости от штамма вируса симптомы могут изменяться от небольших полос, покрывающих всю поверхность листа, до удлинённых полос. У ячменя симптомы, вызываемые лёгкими штаммами BSMV, почти не видны. Симптомы у различных сортов-хозяев могут варьировать от светло-зелёных или хлоротичных полос до хлороза и некроза. Семена растений, заражённых BSMV, мелкие и сморщенные.

Отбор образцов для диагностики на наличие РНК вируса штриховатой мозаики ячменя проводится согласно указаниям ГОСТ 13586.3-2015 Зерно. Правила приёмки и методы отбора проб (с Поправкой) и EPPO Standards PM3/034(1) Barley stripe mosaic hordeivirus. Inspection and test methods for barley seeds.

«Barley stripe mosaic virus-РВ»

Набор реагентов для обнаружения РНК вируса штриховатой мозаики ячменя методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» предназначен для обнаружения РНК вируса жёлтой карликовости ячменя. Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК Barley stripe mosaic virus. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Barley stripe mosaic virus.

Диагностика растений на вирус ячменя с помощью набора «Barley stripe mosaic virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций.

Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент гена белка оболочки (cp) вируса жёлтой карликовости ячменя — по каналу флуоресценции ROX/Orange, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% целевых вирусов, последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 10.06.2019 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Чувствительность
  Для испытания аналитической чувствительности набора был произведен ряд из восьми десятикратных разведений полученной РНК изолятов PV-0330 Barley stripe mosaic virus средней заражённости (16,4 ct). Положительная реакция наблюдалась при разведении исходного инокулюма в 10⁶ раза. При разведении в 10⁷ реакция была нестабильной. При разведении в 10⁸ раз специфичной реакции не отмечено.
  
  Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» — не менее 3,0*10³ копий кДНК в миллилитре пробы.
• Специфичность
  При проверке на специфичность использовались РНК близкородственных, сопутствующих и целевых штаммов вирусов следующих коллекций: DSMZ, Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»).
  
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК целевых вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).

Примеры анализа на выявление РНК вируса штриховатой мозаики ячменя с использованием набора реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: