Выявление РНК вируса мозаики пепино с помощью набора реагентов «Pepino mosaic virus-РВ»

«Pepino mosaic virus-РВ»

Вирус мозаики пепино (РерМV) является представителем семейства Potexvirus. Впервые был описан в 1980 г. (Jones et al., 1980) при выделении из растений пепино (Solanum muricatum). С момента первого обнаружения получил широкое распространение по всему миру и в 1999 г. был впервые выявлен в Европе, в настоящее время распространен в большинстве стран ЕОКЗР. РерМV входит в список ограниченно распространенных карантинных видов — А2 ЕОКЗР.

Вирус мозаики пепино имеет достаточно узкий круг растений-хозяев и в первую очередь поражает паслёновые. Основными растениями-хозяевами являются томаты и пепино, кроме того, вирус поражает баклажан, картофель, перец, табак.

Степень заражения растений варьируется от незначительной до тяжелой в зависимости от штамма вируса и внешних условий: в осенние и зимние месяцы, когда уровень освещенности и температура несколько ниже, симптомы заражения проявляются наиболее ярко. В настоящее время обнаружено 4 штамма вируса пепино, инфицирование которыми сопровождается сильной дифференциацией симптомов проявления заболевания на растениях и плодах. Основные симптомы — мраморность, неравномерная окраска, обесцвечивание, иногда растрескивание плодов и их деформация. Для листьев характерна мозаичная окраска, хлороз, деформация, пузырчатость.

РерМVобладает высокой вирулентностью и в основном передается механически через заражённые инструменты, обувь, одежду, руки и контакт между растениями. Плоды, листья и корни могут содержать значительные концентрации вируса. При повреждении или гибели последних вирусные частицы могут попадать в почву или сточные воды, что также способствует дальнейшему распространению инфекции. Вирус способен сохраняться на внешней оболочке семян, полученных от инфицированных растений.

Переносчиками вируса являются тли (Myzus persicae) и белокрылки (Trialeurodes vaporariorum), а также, как показали эксперименты в теплице, векторами могут выступать некоторые виды шмелей-опылителей (Bombus terrestris, B. canariensis и B. Impatiens).

«Pepino mosaic virus-РВ»

Набор реагентов для выявления РНК вируса мозаики пепино методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Диагностика растений на наличие вируса с помощью набора «Pepino mosaic virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ).

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль карантинного фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК вируса мозаики пепино. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Pepino mosaic virus.

Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Pepino mosaic virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций. Набор реагентов «Pepino mosaic virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент Pepino mosaic virus — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Первая реакция позволяет обнаружить последовательность специфического фрагмента РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Специфичность
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК РерМV, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих специфические фрагменты РерМV, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).

Примеры анализа на выявление РНК вируса мозаики пепино с использованием набора реагентов «Pepino mosaic virus-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: