Выявление РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата с помощью набора реагентов «Tomato brown rugose fruit virus-РВ»

Набор реагентов «Tomato brown rugose fruit virus-РВ»

Вирус коричневой морщинистости плодов томата (ToBRFV) является опасным патогеном таких овощных культур, как томат и перец. Впервые вирус был обнаружен и описан в 2015 году в Иордании и Израиле. Вирус передаётся механическим путем во время обработки растений, транспортировки. Передача ToBRFV также происходит через заражённые инструменты, руки, одежду, почву и непосредственно от растения к растению. Он может распространяться и насекомыми-опылителями — пчёлами и шмелями.

Заражение вирусом коричневой морщинистости плодов томата приводит к мозаичному окрашиванию листьев, а также обесцвечиванию и деформации плодов. В частности, он вызывает пожелтение жилок листа, а также коричневые морщинистые пятна на плодах. Пятна на плодах развиваются в течение 12-18 дней после заражения. Жёлтые пятна в основном концентрируются вокруг цветоножки.

На данный момент против вируса нет эффективных способов защиты, однако компания Bayer уже проводит тестирование сортов, устойчивых к патогену. Вирус может проникать в растение через микротравмы, вызванные физическим контактом с любым носителем, ранее имевшим контакт с патогеном: растениями, рабочими инструментами, одеждой, насекомыми-опылителями, птицами или поливной водой. Попав на растение, он распространяется от клетки к клетке и проникает во все ткани. Вирус может сохраняться в почве несколько лет, не теряя своей вирулентности, а также способен передаваться через семена.

В марте 2020 года рабочая группа ЕОКЗР по фитосанитарным рискам предложила добавить вирус коричневой морщинистости плодов томата в А2 список карантинных организмов в связи с его быстрым распространением по миру.

На сегодняшний день вирус коричневой морщинистости плодов томата включен в список А2 ЕОКЗР.

«Tomato brown rugose fruit virus–РВ»

Набор реагентов для выявления РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Диагностика растений на наличие вируса с помощью набора «Tomato brown rugose fruit virus–РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ).

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль карантинного фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Tomato brown rugose fruit virus.

Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Tomato brown rugose fruit virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций. Набор реагентов «Tomato brown rugose fruit virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент Tomato brown rugose fruit virus — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Первая реакция позволяет обнаружить последовательность специфического фрагмента РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Специфичность
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих ToBRFV вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих специфические фрагменты ДНК ToBRFV, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).

Примеры анализа на выявление РНК вируса коричневой морщинистости плодов томата с использованием набора реагентов «Tomato brown rugose fruit virus-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: