Выявление РНК вируса бронзовости томата с помощью набора реагентов «Tomato spotted wilt virus-РВ»

Набор реагентов «Tomato spotted wilt virus-РВ»

Тосповирус бронзовости томата (Tomato spotted wilt virus) имеет один из самых больших диапазонов растений-хозяев среди растительных вирусов: в 1986 году был составлен список хостов, который уже тогда включал 271 вид из 34 семейств двудольных и 7 семейств однодольных растений. Основными растения-хозяевами являются перец стручковый Capsicum annuum, латук посевной Lactuca sativa, табак обыкновенный Nicotiana tabacum, томат Lycopersicon esculentum и различные декоративные культуры.

Перенос и инфицирование здоровых растений осуществляют трипсы, чаще всего Табачный трипс (Thrips tabaci). Вирус длительное время сохраняется в организме насекомых. Заражённая взрослая особь может быть переносчиком вируса всю жизнь и передавать его потомству.

Обычно заражение происходит от многолетних растений, а распространение от инфицированных томатов незначительно. Иногда заражение осуществляется во время пасынкования. Инкубационный период может длиться от 7 до 25 суток.

Симптомы поражения у растений зависят от условий произрастания, окружающей среды, возраста и могут варьировать от растения к растению. Чаще всего симптомы проявляются в двух формах.

Первая — классическая (обыкновенная) бронзовость. На лицевой стороне листовой пластинки формируются единичные или многочисленные кольца, кружки или пятна угловатой формы. В первое время пятна имеют бронзовый оттенок, впоследствии буреют из-за некроза. Незрелые плоды покрыты крупными поверхностными пятнами концентрической структуры бледно-коричневого цвета. При созревании плодов они приобретают светло-жёлтый оттенок. Пятна обычно начинают формироваться около плодоножки, стебель покрывается некротическими продолговатыми пятнами, и отмирает верхушечная часть растения.

Вторая форма — некротическая бронзовость. Отличается глубоким проникновением пятен в ткани. Из-за этого пятна на листьях и черешках чёрные, концентрические. Листья усыхают, а на плодах образуются глубоко проникающие кольца коричнево-чёрного цвета.

Вирус широко распространен повсеместно в зоне выращивания томатов в открытом грунте. На сегодняшний день вирус бронзовости томата включен в список А2 ЕОКЗР.

«Tomato spotted wilt virus-РВ»

Набор реагентов для выявления РНК вируса бронзовости томата методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещённой с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Диагностика растений на наличие вируса с помощью набора «Tomato spotted wilt virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ).

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль карантинного фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК вируса бронзовости томата. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Tomato spotted wilt virus.

Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Tomato spotted wilt virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций. Набор реагентов «Tomato spotted wilt virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент Tomato spotted wilt virus — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Первая реакция позволяет обнаружить последовательность специфического фрагмента РНК вируса бронзовости томата. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Специфичность
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих специфические фрагменты РНК Tomato spotted wilt virus, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия)

Примеры анализа на выявление РНК вируса бронзовости томата с использованием набора реагентов «Tomato spotted wilt virus-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: