Выявление ДНК грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum с помощью набора реагентов «Colletotrichum acutatum complex-РВ»

Набор реагентов «Colletotrichum acutatum complex-РВ»

Грибы видового комплекса Colletotrichum acutatum являются возбудителями антракнозов на многих растениях-хозяевах. Наиболее подвержены заболеванию растения родов Fragaria, Citrinae, Malus, Olea, Vaccíniu.

Данный видовой комплекс был включён в список регулируемых карантинных объектов Европейской Средиземноморской организации по защите растений (до 2011 г.) и Евразийского экономического союза.

Одним из методов диагностики фитопатогенных грибов является идентификация по морфологии конидий. Это является основным диагностическим признаком C. acutatum, однако U.Damm и др. в 2012 году показали, что веретенообразная форма конидий не является абсолютным показателем для причисления гриба к комплексу C. acutatum: помимо того, что форма конидий видов комплекса C. acutatum варьирует в пределах даже одного штамма, морфы конидий близкородственного комплекса Colletotrichum gloeosporioides имеют схожее строение.

Методы диагностики, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), показывают более высокий уровень как специфичности, так и чувствительности по сравнению с распространёнными на сегодняшний день методами диагностики фитопатогенов.

«Colletotrichum acutatum complex-РВ»

Набор реагентов для выявления ДНК грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор реагентов «Colletotrichum acutatum complex-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный для комплекса видов C. acutatum фрагмент гена TUB2 — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% всех видов комплекса C. acutatum, последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 19.08.2019. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Чувствительность
  Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Colletotrichum acutatum complex-РВ» — не менее 3,0*10³ копий ДНК в миллилитре пробы.
• Специфичность
  При проверке на специфичность использовали ДНК близкородственных, сопутствующих и целевых видов микроорганизмов следующих коллекций: Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH; CIRM-CFBP; ВКМ-ИБФМ РАН; БРЦ ВКПМ; коллекции ФГБУ «ВНИИКР» и АО «Щелково Агрохим».
  
  Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих ДНК целевых грибов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и ДНК микроорганизмов, не содержащих вышеперечисленные фрагменты ДНК, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах для ПЦР в реальном времени — «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК- технология», Россия).

Примеры анализа на выявление ДНК грибов видового комплекса Colletotrichum acutatum с использованием набора реагентов «Colletotrichum acutatum complex-РВ» на приборах для ПЦР в реальном времени: