Выявление ДНК Leptosphaeria maculans с помощью набора реагентов «Leptosphaeria maculans-РВ»

Leptosphaeria maculans – грибной патоген, вызывающий чёрную ножку крестоцветных, так же известную как фомоз крестоцветных, одно из наиболее опасных заболеваний рапса, масличной и листовой горчицы, и других культур семейства Brassicaceae.

Впервые описан в Европе на диких видах семейства крестоцветных. В настоящее время распространен в Европе, Северной Америке, Австралии, Азии (включая Россию). Включён в A2 List EPPO, как карантинный объект, представляющий высокий риск для производства рапса (Fernando W. G. D. et.al., 2016; EPPO Reporting Service, 2025).

Основными растениями-хозяевами являются озимый и яровой рапс (Brassica napus), а также другие культивируемые крестоцветные (Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica nigra, Sinapis alba). Альтернативными некультивируемыми хозяевами могут выступать некоторые дикие виды семейства Brassicaceae (Capsella bursa-pastoris, Raphanus raphanistrum), с помощью которых патоген способен сохранять жизнеспособность и распространяться. Основным источником заражения служат инфицированные растительные остатки (стебли, стручки) и семена, где гриб сохраняет жизнеспособность до 4 лет. Первичное заражение происходит с растительных остатков или семян путем распространения аскоспор ветром или конидий с помощью капельной влагой через раны и устьица на листьях и стеблях растений (West J. S. et. al., 2024).

Основные симптомы заражения Leptosphaeria maculans у взрослых растений затрагивают все органы. На листьях формируются серо-бурые пятна с тёмной каймой, чёрными пикнидами и растрескиванием. На стеблях в прикорневой зоне возникают серо-коричневые язвы с продольными трещинами. На стручках появляются серо-бурые пятна, сопровождающиеся деформацией, образованием щуплых семян с пикнидами и розовым конидиальным экссудатом. Характерный диагностический признак – наличие чёрных пикнид на всех поражённых органах.

При благоприятных для патогена условиях (высокая влажность, 15–20°C) на листьях развиваются некротические пятна, мицелий распространяется по сосудистой ткани растения к стеблю, где развиваются стеблевые язвы, снижающие урожайность за счет нарушения транспорта веществ, в сосудах стебля развивается некроз, ослабляя растение и приводя к угнетению роста растения и гибели. Инфекция стручков менее распространена, приводит к заражению семян, что способствует распространению патогена в новые ареалы. Симптомы усиливаются при севообороте с чередованием крестоцветных менее чем через 4 года. (Howlett B. J. et. al., 2001)

Набор реагентов для выявления ДНК Leptosphaeria maculans методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала в целях обнаружения Leptosphaeria maculans. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце ДНК Leptosphaeria maculans.

Набор реагентов «Leptosphaeria maculans - РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагмент ДНК Leptosphaeria maculans – по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) – по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow/VIC. Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

• Чувствительность
  Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Leptosphaeria maculans-РВ» — не менее 2*10³ копий ДНК в миллилитре пробы.
• Специфичность
  Специфичность – ложноотрицательные результаты при анализе образцов, содержащих ДНК целевого объекта, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: Gentier 96Е (Tianlong, Китай), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США), «CFX96» («BioRad», США), «DT» («ДНК-технология», Россия), «Rotor Gene» (Qiagen), «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия)