Обнаружение РНК андийского латентного вируса картофеля набором реагентов «Andean potato latent virus-РВ»

Андийский латентный вирус картофеля (APLV) из рода Tymovirus

Андийский латентный вирус картофеля (APLV) относится к роду Tymovirus. Ранее к вирусу APLV относили три группы серологических штаммов CCC, Col-Cay, Hu. Позднее, в 2013 году, группу вирусов, которые относились к штаммам Hu, определили в отдельный вид — Andean potato mild mosaic virus.

Распространение APLV ограничено Андийским регионом Южной Америки. Основными растениями-хозяевами являются картофель Solanum tuberosum и уллюко клубненосный Ullucus tuberosus. Симптомы зависят от штамма вируса, сорта растения-хозяина и климатических условий: обычно они малозаметны, иногда проявляются в виде хлоротичной сетки на листьях или в форме мозаики.

Региональные организации по защите растений рекомендуют строгие меры защиты и фитосанитарной сертификации как для продовольственного, так и для посадочного материала картофеля из Южной Америки. На сегодняшний день вирус включен в список А1 ЕОКЗР и в первый список единого перечня карантинных объектов Евразийского экономического союза.

Набор реагентов «Andean potato latent virus-РВ»

Набор реагентов для обнаружения РНК андийского латентного вируса картофеля методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещенной с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)

Набор реагентов «Andean potato latent virus-РВ» предназначен для обнаружения РНК андийского латентного вируса картофеля. Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала, в целях обнаружения РНК Andean potato latent virus.

Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Andean potato latent virus. Диагностика растений на вирусы картофеля с помощью набора «Andean potato latent virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Andean potato latent virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций.

Набор реагентов «Andean potato latent virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичные фрагменты Andean potato latent virus — по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль (ВПК) — по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.

Первая реакция позволяет обнаружить ген оболочки (cp) вируса Andean potato latent virus. Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% целевых вирусов, последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 25.03.2019 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Реакция ВПК необходима для исключения ложноотрицательных результатов.

Чувствительность

Для испытания аналитической чувствительности набора был произведен ряд из восьми десятикратных разведений полученной РНК изолятов PV-0060 Andean potato latent virus средней заражённости (21,4 ct). Положительная реакция наблюдалась при разведении исходного инокулюма в 10⁴ раза. При разведении в 10⁵ реакция была нестабильной. При разведении в 10⁶ раз специфичной реакции не отмечено.

Специфичность

При проверке на специфичность использовались РНК близкородственных, сопутствующих и целевых штаммов вирусов следующих коллекций: DSMZ, Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»).

Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК целевых вирусов, отсутствовали. Ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.

Апробация и примеры анализа

Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).